作业帮rna探针制备时为什么将模板线性化
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/05/06 17:21:28
rna探针制备时为什么将模板线性化
rna探针制备时为什么将模板线性化
rna探针制备时为什么将模板线性化
在RNA的杂交检测实验中,应用标记的RNA 探针将获得高灵敏度的杂交检测结果,与DNA 探针相比,检测灵敏度提高10-100倍.因为对于不同的杂交体类型来说,RNA-RNA杂交体的结合强度高于RNA-DNA和DNA-DNA杂交体.对于通过Northern blots检测低浓度mRNA,以及原位杂交的核酸定位检测等应用,RNA探针是一种理想选择.RNA探针同样也适用于Southern blots,文库筛选,斑点杂交等应用.但是,在RNA探针制备过程和整个杂交实验过程中,必须注意RNAse的防污染操作.
制备RNA探针的常用方法是构建含探针标记模板的重组质粒,将克隆子的转录区下游进行限制性酶切线性化后,进行体外转录的探针合成反应.当然,采用的质粒上必须含有SP6,T3或T7 RNA聚合酶的启动子序列.体外转录法合成的探针量很大,通常情况下,1μg的DNA模板进行反应,将得到20μg的标记RNA探针.
另一种更加直接的体外转录标记法,是先通过PCR方法制备DNA探针模板.扩增引物需要特殊设计,包含SP6,T3或T7 RNA聚合酶的启动子序列.
对于原位杂交的应用,为了更好地进行杂交反应的质控,建议在制备反义链探针的同时,也制备正义链的探针,用作杂交实验的阴性对照.在原位杂交实验前,首先通过Northern blots实验验证探针的有效性和目标转录子在不同样本中的表达模式,有助于简化后续原位杂交实验的优化流程和结果解释.
制备RNA探针的常用方法是利用含有探针序列的重组质粒进行体外转录得到的。 如果不对重组质粒线性化就进行体外转录的话，RNA合成酶会在质粒序列上转很多圈才停止转录（一般的重组质粒都不会有体外转录用的RNA聚合酶（一般是 T3 或T7 RNA聚合酶）可识别的转录终止子），转录出来的RNA会很长很长。因此需要线性化以避免RNA合成酶停不下来……（RNA合成酶的持续合成能力【processivity】一般...
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制备RNA探针的常用方法是利用含有探针序列的重组质粒进行体外转录得到的。 如果不对重组质粒线性化就进行体外转录的话，RNA合成酶会在质粒序列上转很多圈才停止转录（一般的重组质粒都不会有体外转录用的RNA聚合酶（一般是 T3 或T7 RNA聚合酶）可识别的转录终止子），转录出来的RNA会很长很长。因此需要线性化以避免RNA合成酶停不下来……（RNA合成酶的持续合成能力【processivity】一般都很强）
我们实验室做体外翻译实验的时候有人就犯过这样的错误，没有把模板线性化，结果翻译出来的荧光蛋白质含量比文献高很多，荧光强度比别人报道的高了好几个数量级…而且不同实验批次的荧光强度偏差很大…
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